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細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)這三個步驟就能搞定!
更新時間:2025-05-21   點(diǎn)擊次數(shù):11次

一、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,在37C水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中,加入10m預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基,輕輕吹

勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。

加入10mIDMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10mIDMEM培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10mIPBS清洗2次。加入3mI含0.25%EDTA,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1mIDMEM

培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10mIPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10mIPBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹

勻,吸取10微升進(jìn)行計數(shù),按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10mIPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入ImIDMEM

培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mIPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。

加入Iml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80C冰箱內(nèi),過夜,

第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。

凍存液的配制:70%的培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。

進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時,必須嚴(yán)格按照下列步驟操作:

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題,不確定的溶液和耗材請勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶

液。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時,必須嚴(yán)格按照下列步驟操作:

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題,不確定的溶液和耗材請勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶

液。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量,需要的話及時進(jìn)行補(bǔ)充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋,實(shí)驗(yàn)開始可以把所有瓶蓋旋松。

③盡量不要直接傾倒溶液,除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗,溶液粘在瓶口,請用噴過75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍(不要接

觸到瓶口)后在火焰上簡單燒灼。

操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,必須及時更換。

實(shí)驗(yàn)完畢及時收拾,保持工作區(qū)域清潔整齊,后用75%酒精清潔臺面。

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