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如何進行單個細胞的PCR分析
更新時間:2019-08-07   點擊次數(shù):1654次

單個二倍體細胞

在分析單精zi以前,Li等人對個體二倍體細胞內(nèi)的β珠蛋白基因進行過研究。兩 個組織培養(yǎng)細胞株用于這些實驗。其中一個純合是鐮刀型細胞密碼子6(βS)發(fā)生突 變,另一個純合子則來源于正常的βB等位基因。擴增含有密碼子6的β珠蛋白片段的 引物,及能夠區(qū)別這兩個特異的等位基因的寡核苷酸探針(ASO)已經(jīng)報道過。βA純 事細胞和βB純合細胞和βS純合細胞在同一組織培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)數(shù)天。將用相差顯 微鏡觀察到的混合培養(yǎng)的單個細胞轉(zhuǎn)入溥塑料胡管內(nèi)。

 

分別將單個細胞轉(zhuǎn)入含裂解液 的PCR管中,保溫后,加入PCR緩沖液,緩中有四種dDNP.Taq dna聚合酶和擴增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA,然后根據(jù)已發(fā)表方法的改進方案進行 50全循環(huán)的擴增。通過打點雜交,等量的擴增產(chǎn)物打點于尼龍膜后,擴增產(chǎn)物分別與 βA和βS的探針雜交。所分析的37個細胞中,84%細胞只與βA和βS探針雜交,雜交 強弱各不相同;19個與βA探針.12個與βS探針雜交。

 

12個以水作空白對照的反應(yīng)管 中瓜呈陰性,它表明忽略不記DNA的污染。沒有與兩種探針都雜交的樣品,它暗示轉(zhuǎn) 入到反應(yīng)管中的單個細胞,而且組織培養(yǎng)基中存在的從βA或βS細胞中裂解出來的 DNA并未吸附在單個細胞上。

 

單個細胞的pcr擴增產(chǎn)生的β珠蛋白基因的數(shù)量通過與已知攜帶蛋白基因的質(zhì)粒 DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強度進行比較確定。據(jù)估計PCR反應(yīng)開始時,一個二 倍體細胞珠蛋白DNA量(3.0X10-24摩爾)在5-500毫微微摩爾之間,每個PCR循環(huán)以 平均效率65%計算,經(jīng)50個循環(huán)后它的DNA相當于平均擴增了7.6×1010倍??紤]到擴 增的程度之大,因此排除任何可能的污染對于單個細胞的分析十分關(guān)鍵。

 

單精zi的分析

我司等人隨后對位于染色體19編碼LDL受體(LDLr)的基因的雜合體單精zi的基因型 進行分析。根據(jù)已知的DNA序列,他們用PCR和ASO分析檢測LDLr的RFLP。PCR的引物和 探針以前已有報道。單個精zi的分離與二倍體細胞的分離方法一樣,經(jīng)蔗糖梯度 離心得到純化的精zi,精zi于-20℃可保藏8個月。

 

顯微鏡下將單個精zi吸入毛細塑 料針管內(nèi),然后轉(zhuǎn)入試管內(nèi)以作裂解。裂解的方法與發(fā)表的方法沖液(50mM KCL, 10mM Tris.HCL,pH8.3,2.5mM MgCl2,0.1mg/ml明膠),0.05mg/ml蛋白酶K,20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保溫1小時,加入pcr反應(yīng)物以前,樣品加熱到85℃。PCR擴 增。

 

對80個精ziLDLr基因型已作過分析。55%的雄配子顯示出雜交信號。22個攜帶 LDLr等位基因,21個攜帶LDLr2基因。僅一個與兩種探針雜交都呈陽性。16支對照反 應(yīng)管中加入所有反應(yīng)試劑但沒有精zi,結(jié)果無雜交信號出現(xiàn)。

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